上篇文章，我們已經(jīng)介紹了一部分CCK8試劑盒日本同仁的常見問題，本文將繼續(xù)為大家講解。

　　1、實(shí)驗(yàn)之前，是否需要先檢測一下培養(yǎng)基和CCK-8是否會反應(yīng)?建議使用一個(gè)孔作一下檢測，因?yàn)橛信囵B(yǎng)基中可能含有氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)，在正式實(shí)驗(yàn)之前有必要先確認(rèn)培養(yǎng)基和CCK-8是否反應(yīng)。一般正常在的OD值應(yīng)該在0.4以下。

　　2、如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響?金屬對CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話，將會100%抑制。

　　3、CCK8試劑盒日本同仁試劑的保存條件?在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時(shí)間的話，推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復(fù)解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內(nèi)保存。

　　4、如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差?可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

　　5、CCK8試劑盒日本同仁是什么顏色?應(yīng)該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。

　　6、設(shè)定參比波長的目的是什么?必須設(shè)定嗎?不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。

　　7、說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板貨12孔板，應(yīng)該加多少量CCK-8試劑?一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10。

　　8、在CCK-8顯色過程中，如何終止反應(yīng)?有一下幾種方法(96孔板)： 1、 在顯色反應(yīng)后，將培養(yǎng)板放置4℃冰箱內(nèi)。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意：反應(yīng)停止后，應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)測定。

　　9、必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎?不一定。如果要向保持細(xì)胞的狀態(tài)，建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)，但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測時(shí)需要統(tǒng)一檢測條件。

　　10、預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎?一般情況下用胰蛋白酶處理對數(shù)增長期的細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)，制備成一定濃度的細(xì)胞懸液即可。如果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì)數(shù)盤進(jìn)行計(jì)數(shù)。

　　11、CCK8試劑盒日本同仁對于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣?不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對于貼壁細(xì)胞，一般加入CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細(xì)胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。

　　12、懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別?懸浮細(xì)胞由于染色比較困那，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間。貼壁細(xì)胞染色比較容易，若細(xì)胞數(shù)量過大，有時(shí)吸光度會超過酶標(biāo)儀的讀數(shù)。

　　13、應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎?建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　14、有時(shí)在藥物作用情況下，細(xì)胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計(jì)算細(xì)胞數(shù)量?不能。由于CCK8試劑盒日本同仁是通過和細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶進(jìn)行反應(yīng)間接反映活細(xì)胞數(shù)量，如果細(xì)胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細(xì)胞數(shù)量將會比真實(shí)值高，不能真實(shí)反映活細(xì)胞數(shù)量，建議采用別的方法測定。

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