今天讓我們一起來了解一下CCK8試劑盒日本同仁的操作方法是什么吧。
 

　　一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(測定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí))
 

　　1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。
 

　　2、按比例(例如：1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。
 

　　3、接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X軸)，OD值為縱坐標(biāo)(Y軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
 

　　根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量(試用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK后的培養(yǎng)時(shí)間。)
 

　　二、細(xì)胞活性檢測
 

　　1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100μL/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)(在37℃,5% CO2的條件下)。
 

　　2、向每孔加入10 μL的CCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))。
 

　　3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
 

　　4、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。
 

　　5、如果暫時(shí)不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
 

　　三、細(xì)胞增值-毒性檢測
 

　　1、在96孔板中配置100μL的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(在37℃，5% CO2的條件下)。
 

　　2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測物質(zhì)。
 

　　3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如：6、12、24或48小時(shí))。12后/24h
 

　　4、想每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))。
 

　　5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。(2h后)
 

　　6、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。
 

　　7、如果暫時(shí)不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
 

　　注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基(除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基)，去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。